试剂盒介绍：

 基因定点突变是一种对质粒DNA序列上的指定碱基进行体外定点替换、插入或缺失等序列改变的基因操作技术，在蛋白质结构与功能以及DNA表达调控研究中是一种非常重要的技术。基因定点突变试剂盒在不需要特殊载体、不需要T4 DNA 连接酶、不需要亚克隆的条件下可以对指定碱基进行突变。试剂盒使用了具有快速扩增性、超高保真性和强大扩增能力特点的Xerox DNA聚合酶，只需以甲基化质粒为模板进行一次PCR扩增、一次酶切消化和一次转化就可以在一天之内完成基因突变过程，整个过程非常简单。该试剂盒也可以同时对多个位点进行突变。

突变原理：

1.在Xerox DNA 聚合酶的作用下，突变引物以质粒为模板扩增出互补链，产生的互补链包含已突变碱基。

2.特异性降解甲基化DNA的限制性内切酶SDM (Site-Directed Mutagenesis)Enzyme可以选择性地降解原始质粒模板。PCR产生的互补链因DNA没有甲基化，不能被SDM酶降解。

3.SDM处理过的产物转化细菌后，质粒中的断点可被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期突变的质粒。

引物设计基本原则（阴影部分为突变区双链DNA序列）

(1)共需设计两条互补的引物。可以先设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。扩增时，两条引物反向延伸。 见实验例1和例2。

(2)引物的长度通常为30-40个碱基，通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，GC%在40%以上。但引物也不宜过长，否则会形成非常稳定的二级结构,导致引物和模板结合困难。

实验例1：碱基G突变成碱基A设计的突变引物为

F1:5-GTGCCTTGGGTGGCTTTAGGGCATGGACATTGACC-3

R1:5-GGTCAATGTCCATGCCCTAAAGCCACCCAAGGCAC-3

实验例2：碱基AAG突变成碱基TAA

设计的突变引物为:

F2:5-GAGGAGATTAGGTTATAAGTCTTTGTATTAGGAG-3

R2:5-CTCCTAATACAAAGACTTATAACCTAATCTCCTC-3

2.对两个位点同时进行突变的引物设计基本原则

共需设计两条同方向的引物。扩增时，两条引物沿一个方向延伸。见实验例3。

实验例3

设计的突变引物为:

F1 5-CCTCTGCACGTTGCATGAAGACCACCGTGAACGC-3

F2 5-GAGGAGATTAGGTTATAAGTCTTTGTATTAGGAG-3

3.突变引物合成和配制

 使用经过PAGE纯化或FPLC纯化等高纯度引物。如果合成得到的突变引物A的量是2.3nmol，另一个引物B的量是2.1nmol。分别在引物A中加入23μl灭菌水，在引物B中加入21μl灭菌水，配成浓度为100μM的储存液。吸取5μl的100μM引物A，再加入45μl水，混匀后即可得到50μl直接用于突变实验的工作浓度(10μM)的引物A。引物B的工作液可按引物A的稀释方法配制。

二、质粒模板要求

  只能使用从基因型为dam^＋的大肠杆菌(这类菌中质粒DNA可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。包括DH5α、TOP10、DH10B、Mach1-T1、BL21、JM109等常用的大肠杆菌都是dam^＋的。用于扩增的质粒模板一定要纯，含有RNA的质粒会导致DNA定量不准，突变前一定要对质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认质粒的质量和数量。 如果质粒模板GC含量较高，在70%以上，请在突变反应中补加促进高GC模板扩增的增强试剂，如DMSO等。